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酶底物法检测地表水粪便污染的适用性探讨

  酶底物法检测地表水粪便污染的适用性探讨

  摘要:为探讨酶底物法检测地表水粪便污染的适用性,采用酶底物法与多管发酵法同步检测了长江南京段、秦淮河、玄武湖等水中大肠菌群。结果显示:在多数情况下,酶底物法检测结果略低于多管发酵法,两种方法没有统计学差异(P>0.05);与多管发酵法相比,酶底物法检测粪便污染特异性强、时间周期短、二次污染小、简便快捷,适于推广应用。

  判断水体是否受到粪便污染,目前主要以粪大肠菌群、大肠埃希氏菌和总大肠菌群作为指标,采用的检测方法主要为多管发酵法已经采用多年,检测周期长、操作繁琐,难以适应当前环境检测工作需要。滤膜法不适用于浊度大的水样,而且对过滤体积的判断也直接影响最终结果。快速纸片法简单、快速,是一种不错的新方法,已经在许多实验室中应用,但是,开放式培养使其二次污染增加,给操作者带来一定的潜在危险。

  酶底物法是近年来出现的一种新型酶技术检测方法,具有快速、特异、无污染等优点,美国EPA已经将它列为饮用水生物安全指标总大肠菌群和大肠埃希氏菌的推荐方法,并于1998年将水体受粪便污染的评价指标改为粪大肠菌群与大肠埃希氏菌并行,鼓励逐步用大肠埃希氏菌指标代替粪大肠菌群指标。我国卫生部在2006年也将酶底物法列入瓶装水、饮用水、水源水中总大肠菌群行业大肠埃希氏菌检测方法。但在环境检测领域,尚未见酶底物法的相关规定,笔者通过对比酶底物法与多管发酵法同步检测南京市长江南京段、秦淮河、玄武湖、花神湖等水体的结果,探讨用酶底物法代替多管发酵法检测地表水粪便污染的可行性。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  多管发酵法所用培养基

  酶底物法所用培养基等材料

  采用样品集自长江南京段、秦淮河、玄武湖、花神湖等水体。

  1.2.1 多管发酵法

  按《水和废水分析监测方法(第四版)》操作,每个样品接种3个稀释度,每个稀释度接种5管,共15管,置37℃下培养24h,观察结果。如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸,则为初发酵阴性。如有产酸产气者,则转种EC培养基,在44.5℃下培养24h,有产酸产气者,证实有粪大肠菌群阳性。查粪大肠菌群MPN检索表,为每100ml稀释水样的MPN值,换算每升水样的MPN值,以MPN/L表示最终结果。

  1.2.2 酶底物法

  按《生活用水标准检验方法》(GB5749-2006)和文献操作。根据水样含菌量多少及稀释倍数,采用97孔定量盘法,用无菌培养瓶量取稀释后水样100ml,加入培养基粉,混匀,然后将100ml水样倒入97孔定量盘内,用程控定量封口机封口,在44.5℃±0.5℃下培养24h,若孔内水样变黄则为阳性,计数呈阳性反应的孔数,查酶底物法最可能数(MPN)表,该结果为MPN/100ml,最终结果以MPN/L表示。

  1.3 数据统计分析

  按《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)将所测样品分为3档;I、II类水为清洁水;III类水为清污染水;IV、V类水为重污染水。用Excel软件进行数据统计处理,用T检验分别比较两种方法检测结果的显著性差异。

  2结果与分析

  2.1清洁水组

  对19例I、II类水样进行了多管发酵法与酶底物法同步检测,结果(表1)显示:酶底物法检测结果均值为905MPN/L,从统计学角度略低于多管发酵法,酶底物法检测结果低于多管发酵法的有12例占63%。用Excel对数据作成对双样本均值T检验,多管发酵法、酶底物法的平均值分别为1091.67和904.72,t=1.55,P>0.05,表明两种方法对清洁水样的粪大肠菌群检测,结果无显著差异。

图片11.jpg

  2.2轻污染水组

  对12例III类水进行了两种方法的同步分析,结果见表2。结果显示:酶底物法检测结果均值为3799.33MPN/L,从统计学角度低于多管发酵法,酶底物法检测结果低于多管发酵法的有8例,占67%。用Excel对数据作为成对双样本均值t检验,多管发酵法、酶底物法的平均值分别为4741.67和3799.33,t=1.51,P>0.05,表明两种方法对轻污染水样的粪大肠菌群检测,结果无显著性差异。

图片22.jpg

  重污染水组

  对22例IV,V类水进行了两种方法的同步分析,结果见表3。结果显示:酶底物法检测结果平均值为5.42×106,t=1.06,P>0.05,表明两种方法对污水样的粪大肠菌群检测,结果无显著性差异。

图片33.jpg

  3.讨论

  与现行国家环保部认可的多管发酵法相比,在检测地表水中的粪大肠菌群时,酶底物法检测结果多数情况下略低,但在统计学上无显著差异性(P>0.05)分析主要原因有:

  (1)从检测指标定义看,多管发酵法检测的是在44.5℃下培养24h能产生β-半乳糖柑酶分解色原底物使培养基呈颜色变化的大肠杆菌。

  (2)从检测试验的机理看,酶底物法采用特异的酶技术,具有特异性,可以减少杂菌的干扰,因此假阴性、假阳性低;而多管发酵法难于排除15%的假阴性(自然界天然存在的非粪便来源的克雷伯氏菌)和10%的假阴性(10%左右的不产气大肠埃希氏菌)。

  (3)比较两种方法的最可能数(MPN)表,从试验结果中阳性管(孔)组合所表征的数据量看,多管发酵法仅有56组,而酶底物法97孔定量盘为2352组,酶底物法比多管发酵法更准确。因此,从指示粪便污染的角度看,酶底物法检测结果能更真实地反映水体污染的程度,可以替代现行的多管发酵法。同时,由于酶底物法具有操作简便、检测周期短、二次污染小等优点,尤其是采用密封培养技术,在检测医院污水时可以减少人员接触而降低检测人员的致病风险,因此具有更强的使用价值和应用价值。

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