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酶底物法测定地表水中粪大肠菌群的研究

    地表水中粪大肠菌群是评价水质受粪便污染程度的重要指标之一,传统上多采用滤膜法或多管发酵法进行检测。但以上两种方法检测耗时较长(48小时左右),实验步骤繁琐。酶底物法可以较好地弥补传统方法的不足,对水质状况做出快速检测。
    一、实验材料
    酶底物试剂;100mL无菌取样瓶(里面装有1.5%的硫代硫酸钠,用于去除水样中的余氯);无菌培养定量盘(5l孔);LK-2014智能程控定量封口机(带5l孔定量盘橡胶托垫);51孔阳性标准比色盘;便携式培养箱。
    二、实验原理
    在培养温度为44.5±1℃条件下,粪大肠菌群细菌能特异性地产生β—半乳糖苷酶(β—D—galactosidase),该生物酶可以分解ONPG(Ortho—nitrophenyl—β—D—Ralactopyranoside,β—半乳糖醛苷),使培养液呈黄色。
    三、实验步骤
    1、用100mL无菌取样瓶取100mL混匀水样。如果水样中粪大肠菌群数大于2005个/L,则酌情少取,并用新配置的超纯水稀释至100mL刻度线。
    2、将酶底物试剂加入取样瓶中,充分摇匀,使试剂完全溶解。
    3、水样溶解完全后倒入无菌培养定量盘(51孔)。
    4、51孔定量盘橡胶托垫在封口机上进行封装。
    5、51孔定量盘封装好后放入44.5±1℃恒温培养箱中培养24h。
    6、24小时后,将51孔定量盘从培养箱中取出,与5l孔阳性标准比色盘进行比较(黄色孔颜色比51孔阳性标准比色盘深的表明为阳性反应)。根据51孔定量盘上的阳性孔数,对照MPN表查出结果。
    四、统计学分析
    数据的整理统计使用execl软件进行。
    五、结果与讨论
    对同一地表水样进行l~200倍不等的稀释时,测定结果范围在4000个/L-8260个/L之间,偏差较大。
    测定结果如表1及图1所示。

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    由表1和图1可以看出,水样不稀释或者稀释两倍时,51孔定量盘的阳性孔数为51孔,表明该水样的粪大肠菌群浓度大于2005个/L;对水样进行4倍或5倍的稀释培养检测时,51孔定量盘的阳性孔数分别为50孔和49孔,测定结果值为8020个/L和8260个/L,两者的平均偏差为1.5%。该结果与传统的多管发酵法的实验结果具有较好的一致性,结果可信。
    而在对该水样进行10~200倍不等的稀释时,检测结果值在7820个/L-4000个/L之间,结果均偏低。由此可见,随着稀释倍数的增大,测定结果值越偏低。因此,在日常检测工作中,检测人员应根据具体情况对水样进行最小倍数的稀释。
    六、结语
    测定水样中的粪大肠菌群数时,酶底物法具有简便、快速、准确的特点。无需无菌室,无需配置培养基,无需清洗玻璃器皿,24小时便可出结果,能够较为准确地判断水样的污染状况。同时,测定水样的稀释倍数会对测定结果有一定的影响。检测人员可根据具体情况对水样进行最小倍数的稀释,以使结果更加真实准确。

 

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