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酶底物法快检技术检测生活饮用水中大肠菌群

    摘要:酶底物法作为近年出现的新型酶技术检测方法,具有快速高效、特异无污染等优势。主要对酶底物法检测生活饮用水中大肠菌群的方法和结果进行讨。

1 实验原理
 
该革新的检测技术利用分别由大肠菌群β-半乳糖苷酶及大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶代谢的两种「营养剂指示剂」:邻硝基苯-β及甲基香豆基葡糖醛酸苷(MUG),作为立科Colitech酶底物法检测试剂试剂的主要碳源。
利用大肠菌群细菌能产生β半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄色,检测大肠菌群。利用大肠埃希氏菌产生β葡萄糖醛酸酶分解MUG使培养液在波长366nm 外光下产生蓝色荧光,检测大肠埃希氏菌。改变培养温度,可检测耐热大肠菌群。因为大多数非大肠杆菌属菌类没有这些酶,所以无法在立科Colitech酶底物法检测试剂里生长及干涉这些物质。而有这些酶的少数非大肠杆菌属菌类会受到立科Colitech酶底物法检测试剂特殊配方的基质选择性的抑制作用(专利技术)。
酶底物法技术特点:1、减少杂菌干扰 2、无培养基干扰(传统方法常会因清洁剂、盐、抗生素、毒素、温度造成抑制 反应) 3、结果准确,减少假阳性反应与假阴性反应 4、测试结果快速,18 或24 小时报告 5、判读容易 6、操作简便,使操作人员从繁杂的检测工作中解放出来。
 
2 仪器设备和试剂耗材
 
(1)LK-2014A型智能程控定量封口机;(2)可充电紫外灯,6W,220V,366nm;(3)紫外线防护镜;(4)立科Colitech酶底物法检测试剂;(5)51 孔定量盘(无菌);97 孔定量盘(无菌)(6)阳性标准比色瓶,阳性51 孔标准比色盘;(7)100mL 含硫代硫酸钠无菌取样袋/瓶。
酶底物检测试剂.jpg
 
(酶底物检测试剂)
 
3 实验方法
 
3.1 定性实验
 
大肠菌群、大肠埃希氏菌:取100mL 水样加入酶底物试剂1 支混匀,于36 1培养24h,观察结果。 耐热大肠菌群:实验同上,但培养温度变为44.50.5 结果判定:可见光下水样变为黄色,报告检出大肠菌群/耐热大肠菌群;紫外灯下水样有蓝色荧光,报告检出大肠埃希氏菌。否则报告未检出。
 
3.2 定量实验
 
51孔定量盘法,97 孔定量盘法 大肠菌群、大肠埃希氏菌:取100mL 水样加入酶底物试剂1 支混匀,转入 51 孔定量盘内(或97 孔定量盘),封口后于361培养24h,观察结果。 耐热大肠菌群:实验同上,但培养温度变为44.50.5 结果判定: 可见光下计数51 孔定量盘内黄色孔数,紫外灯下计数有蓝色荧光孔数,再 查表《51 孔定量盘法不同阳性结果的最可能数MPN 及95%可信范围》或《97 定量盘法不同阳性结果的最可能数MPN及95%可信范围》得出数值,结果以MPN/100mL 报告。
 
4 讨论与分析
 
4.1 酶底物法与多管发酵法的比较
 
 多管发酵法和酶底物法均用于生活饮用水中大肠菌群的定量测定,但两法比较有如下特点:方法接种量不同。多管发酵法水样接种55.5mL,酶底物法水 样接种100mL。方法量程不同。多管发酵法检测范围是2-1600(MPN/100mL), 酶底物法检测范围是1.0-200.5(MPN/100mL)。方法灵敏度不同。多管发酵法为每100mL 样本中2cfu;酶底物法为每100mL 样本中1cfu。方法步骤不同。 多管发酵法为多步骤测定,费时费力;酶底物法为一步测定,省时省力。方法耗时不同。多管发酵法对于阴性水样需24小时报告结果,对于阳性水样则需72 小时报告结果;酶底物法无论阴性或阳性水样均可24 小时报告结果。方法费用不同。多管发酵法可使用半成品培养基或自配培养基,检测成本低廉,目前国内也开发有初发酵试验的成品培养基和一次性耗材,但由于阳性水样必须进行验证试验,从而限制了该商品试剂的应用推广;酶底物法使用商品试剂,且目前只有国外生产商供应,使得检测成本较高,该法在东部经济发达地区使用较广。
 
4.2 酶底物法应用的优势与不足
 
目前我国对生活饮用水进行卫生学评价,检测的微生物指标主要有大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌,这类指标是粪便污染的指示菌。经典的传统方法为多管发酵法,其检测周期较长,需2~5 天,阳性结果需验证试验,使得实验操作步骤较为繁琐,不能对生活饮用水的卫生学状况做出快速评价,特别是在抗震救灾特殊时期,如能实现微生物指标的实时监测,将极大地支持抗震救灾工作地顺利实施,有力保障广大灾区人民群众生活饮用水的供水安全。因此, 酶底物法作为一种快检方法,其快速简便的特点可以较好的弥补传统方法的不足。酶底物法有商品化试剂供应, 实验操作简便,无需确认试验,可同时检测水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌。如果改变培养温度,还可检测耐热大肠菌群。该方法检测周期短,18~24 小时即可报告最终结果。可见该方法最大的特点是节省了时间和人力。 酶底物法的主要缺点是培养基成分复杂,实验室配制困难,目前只有进口试剂可供选择,使得检测成本大为提高。如果能实现试剂的国产化,相信其应用会得到极大地推广。酶底物法的另一个缺点是,在运用于定量检测(51 孔定量盘法)时,其定量范围比多管发酵法窄。酶底物法的最大检测值为200.5 MPN/100mL, 而多管发酵法为1600 MPN/100mL。对于污染比较严重的生活饮用水,酶底物法的定量检测能力不如多管发酵法。遇到这类情况时如需应用酶底物法,则只能先将水样适当稀释后再进行检测。
LK-2014A.jpg
 
(LK-2014A)
 
4.3 卫生标准与检验标准的匹配问题
 
国家标准GB5750-2006《生活饮用水标准检验方法》中规定,测定总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌这三项水质常规指标时可使用多管发酵法,也可以使用酶底物法。该检验标准明确规定,在报告结果时,多管发酵法在所有乳糖发酵管均阴性时报告“未检出”,其真实含义为“<2MPN/100mL”;酶底物法在所有孔均阴性时报告“未检出”,其真实含义为“<1MPN/100mL”。 国家标准GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》中规定,上述三项指标其卫生限值均为“不得检出”。 显然采用两种方法测定的结果,报告“未检出”时其含义是不相同的。但国家卫生标准却未加以说明。我们在实际工作中就遇到了这样的问题。在检测的地震灾区生活饮用水中,使用酶底物法有51 份水样其检测结果为1MPN/100mL,按照卫生标准这些水样均不合格。但如果采用多管发酵法,则这些水样很可能是合格的, 因为多管发酵法的最低检出限为2MPN/100mL。出现这类问题是由于检验标准与卫生标准不匹配造成的。我们建立卫生标准限值改用“<2MPN/100mL”来表示,从而避免上述问题。
 
4.4 酶底物法商品试剂的比较
我们先后使用了两个生产厂家的酶底物商品试剂。使用中我们发现立科Colitech酶底物法检测试剂有两个优点:试剂包装好,使用方便,很少有污染失效试剂;试剂在加入水样后本底颜色很浅,便于实验培养后的阳性阴性结果观察。
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