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检测生活饮用水中总大肠菌群的酶底物法与滤膜法探讨

  生活饮用水水质卫生要求生活用水中不得含有病原微生物,常规检测微生物指标为总大肠菌群、耐热大肠菌群等,这些指标作为检验肠道致病菌的指标菌,是生活饮用水、水源水进行卫生评价的重要内容。

目前检测水中总大肠菌群有三种方法。即多管发酵法(MTF)、滤膜法(MF)、酶底物法(enzyme substrate technique)。多管发酵法需要3部分,即乳糖发酵试验、分离培养、证实试验,该方法步骤繁琐,实验需要无菌条件下,检测时间长,需2-5天,在实际应用中难以改进,有时会低估水样中总大肠菌群数目甚至漏检,制约了其对生活饮用水卫生学状况作出快速评价的应用。因此,采用快速简便、比较灵敏的酶底物法、滤膜法尤为重要,笔者现对这两种方法进行探讨。

  1.材料与方法

1.1材料与试剂


酶底物法所用的培养基、培养瓶和仪器由立科公司提供,滤膜法需培养基,滤器和滤膜。

  1.2实验方法

两种方法均按照GB/T5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法-微生物指标》中规定操作,均在国家实验室认可(CNAS L1985)/计量认证(2012002455S)、国家食品检验机构资质认证(F2012000251)的实验室进行。

1.2.1滤膜法(MF)原理是乳糖发酵的细菌产生乙醛,在存在碱性品红的情况下,乙醛与亚硫酸钠结合形成红色菌落,快速发酵乳糖的细菌产生金属光泽,不发酵乳糖的细菌形成无色透明的菌落。用孔径0.45μm无菌的滤膜过滤水样,然后用灭菌镊子取滤膜边缘部分将滤膜移放至选择性品红硫酸钠培养基上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培养基全贴紧,两者间不得留有气泡,然后将平皿倒置,放入37℃恒温箱内培养24h。挑取符合特征的红色菌落,进行革兰氏染色、镜检,检出为革兰氏阴性无芽孢杆菌,再接种乳糖蛋白胨培养液,于37℃培养24h,有产酸产气者,则判定位总大肠菌群阳性。结果以CFU/100ml表示。

1.2.2酶底物法 用51孔定量盘法,原理是大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶分解ONPG(ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyanside)使培养液呈黄色,检测总大肠菌群;以及大肠埃希氏菌产生β-葡糖糖醛酸酶(β-glucuronidase)分解MUG(4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronidase)使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光,检测大肠埃希氏菌。用无菌培养瓶量取100ml式样,加入(2.7±0.5)MMO-MUG培养基粉末,混摇均匀使之完全溶解,然后将100ml水样全部导入51孔定量盘内,手抚平定量盘背面以赶除孔内气泡,用程控定量封口机封口。放入(36±1)℃的培养箱培养24h,检测结果与比色盘进行对照,将颜色变黄色的水样定量盘在暗处用波长366nm紫外光灯照射,如果有蓝色的荧光产生则表示该定量盘孔穴中含有大肠埃希氏菌。参照比色盘计算有黄色反应的空穴数(总大肠菌群)及有蓝色的荧光产生的空穴数(大肠埃希氏菌),对照MPN检索表得出结果。结果以MPN/100ml表示。

  2.结果

采取吉林省本地8个地区丰水期(8-9月)共计104份自来水水样进行检测。其中16份水样酶底物法、滤膜同时检测均为阳性;34份式样两种方法均为阴性;28份水样酶底物法检测为阳性,滤膜法为阴性;26份水样酶底物法检测为阴性,滤膜法为阳性;对酶底物法、滤膜法检测104份水样总大肠菌群的结果进行配对卡方检验,检验结果表明酶底物法、滤膜法检测总大肠菌群的结果比较差异无统计学意义(x=0.074,P<0.05)。

  3讨论

通过以上试验证明酶底物法、滤膜法检测总大肠菌群结果比较差异无统计学意义(p<0.05),与相关文献报道相符,具有良好的相关性。

滤膜法(MF)采用抽滤装置,具有操作简单、省时(48h)、省料、设备要求低的优点,可以用于检测体积较大的水样,还具有高度的再现性和精密性。缺点是由于受滤膜孔径的限制,在检测混浊度高、非大肠菌群类细菌密度大的水样时,对菌落计数统计有影响,不适用于河湖水等的检测。

酶底物法具有操作简便,检测时间短(24h)、特异性高、精确度高,适用范围比较广。检测总大肠菌群同时还可以检测具有病原学意义的大肠埃希氏菌,能够较快速、准确地判断水样的微生物污染状况,适用用于应对突发公共卫生事件,是目前比较先进方法。缺点是采样瓶、试剂盒定量检测盘都是一次性使用,检测成本大幅提高,对于基层普通水厂无法推广使用。

综上所述,滤膜法适用于自来水厂出厂水及管网水的常规监测;酶底物法适用于疾病预防和突发公共卫生事件等确认试验。对于不同方法,根据具体情况合理选用,有利于提高总大肠菌群检验的准确率,简单、快速地检测水中总大肠菌群等,并节约检测成本。

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